简介从孕前筛查的参考价值来看，也能给其他行业带来很多的启发。
用于检测基因变异的血浆检测方法已经出现。在血液中循环的游
离dna（cfdna）来自身体的各种组织。但只有一部分cfdna能
反应疾病累及的组织，灵敏度不足一直阻碍着液体活检的广泛应
用。直到最近发展出的分子方法才使得高度特异地检测cfdna中
的低频分子生物标记成为了可能。新一代测序（ngs）具有通过
单个样本评估大量已知生物标记，或发现新突变的优势。
虽然液体活检涉及多种生物样本类型，但本文主要讨论血液
cfdna的分析。游离dna对于评估和监测某些疾病特别有用。它
被用来分析孕妇外周血中胎儿dna的遗传异常（非侵入性产前检
测，nipt），监测移植后的器官排斥、传染性疾病和癌症。
肿瘤会释放大量dna，但dna量可能因肿瘤类型而有所不同。
死亡的肿瘤细胞释放的dna称为循环肿瘤dna（ctdna），占血
液总cfdna的一小部分。因此，检测低频率的体细胞突变需要可
靠的检测方法。针对已知变异的高灵敏度、高特异性检测方法已
经被开发出来，而最近开发的全景变异检测，还能够分析肿瘤中
的多种候选基因的新变异。随着这些方法的改进，用于多种应用
的ctdna分析方法也已经被开发出来，例如筛查、治疗选择、监
测和耐药探索。
液体活检与实体组织活检相比有何优势？
作为侵入性较小的检测方法，液体活检在无法获取目标组织时尤
其有价值。即使能够获取患病组织，许多疾病也需要通过再次活
检来进行监测，而cfdna分析在这方面有许多优势。
液体活检样本的采集可以通过常规的取血方法进行，而接受过这
种方法培训的专业人员数量非常多。但组织活检通常需要有资质
的技术人员或外科的专业技能。作为分析中的重要步骤，液体活
检更加经济，其周转时间更短，相关不良事件的发生率更低。在
采集样本后，cfdna的提取方法也已得到了优化，比处理福尔马
林固定石蜡包埋（ffpe）样本更快、更便宜。在组织活检中，获
取用于初始评估或再次活检的特定组织有一定难度。nccn和
amp指南已经进行了修订，推荐将液体活检用于某些肿瘤类型，
特别是在组织活检无法进行的情况下，例如非小细胞肺癌。
1
尽管来自特定组织的ctdna仅占总cfdna的一小部分，但cfdna
分析已经足够完善，能够评估肿瘤异质性并克服组织取样偏差。
监测疾病进展时，可以使用ctdna分析来监测原发灶肿瘤对治疗
的反应，并评估转移灶。配合能鉴定新突变的测序方法，液体活
检对于监测由新突变造成的获得性耐药极为有用。cfdna可在单
个检测中灵敏的评估多个基因，cfdna还可用于全景变异分析。
因此，液体活检不仅能鉴定疾病进展中的新突变，也能鉴定原发
灶以外的组织中发生的突变。
液体活检在现代肿瘤研究中的诸多优势
分子检测的创新使全面、精确的游离dna分析成为可能
来自肿瘤的dna在血液中循环
piom
piom
从血浆中提取游离dna全景变异分析能检测循环肿瘤
dna中的多种变异类型
插入缺失
cnv
msi
snv
dna融合
tmb
1
2
3
4
5
6
图1：?新的分子方法可以通过血浆样本来评估多种生物标记和多种组织?-通过cfdna技术，将数百个标记整合到单个检测中，检测肿瘤全景变异。
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分析ctdna需要使用哪些技术？
分析cfdna最常用的分子方法是定量pcr（qpcr）、微滴式数字
pcr（ddpcr）和ngs。两种pcr方法都涉及使用特异性的dna
探针来靶向特定基因，来定量检测样本中靶标数量。ngs也涉及
使用探针来捕获特定dna片段，但得到的数据是捕获的dna序
列。ngs可以使用多个read来评估存在的靶标分子的数量，因此，
该方法也可以进行定量测量。
qpcr：在本文所述的分子方法中，qpcr是最早开发出来的方法。
qpcr的灵敏度足以进行cfdna分析，并且该方法还具有分析少
量变异时价格低廉、高效的优点。但是，qpcr只能检测少量的靶
标，并且只能分析指定的变异类型，因此其发现价值极低。
ddpcr：ddpcr的准确性优于qpcr，但它需要额外的成本和技
术经验。ddpcr也没有发现价值，其靶标和变异类型数量受限于
特定的检测设计。
ngs：ngs会检出单核苷酸分辨率的dna序列，这使得新变异
的发现成为可能，而且不需要事先知道变异信息来设计。它不
仅可以评估多种变异类型，还能发现新的基因位点突变。因此，
ngs这种无假设方法具有高发现价值，可用于评估任何肿瘤，并
且还有发现新变异的潜力。但ngs在分析少量变异或样本时更昂
贵、耗时。只有当检测设计为覆盖较多的分子靶标时，ngs全面
的特性才更具有效率和经济价值（表1）。
ngs为液体活检提供了哪些优势？
ngs会对数百万个dna片段进行平行测序，然后用计算机将
read比对到基因组。您可以将ngs检测设计得非常全面，覆盖
大量基因靶标和变异类型。随着可利用生物标记数量的持续增加，
需具备将大量生物标记整合到单个检测的能力，而这种能力可能
会在研究和临床环境中变得更有价值。通过避免反复检测，ngs
也具有节约样本、时间和金钱的潜力。
杂交捕获化学技术等测序文库制备方法可以从cfdna样本中分离
靶标基因的大片段。杂交探针可以设计得足够大，以便在杂交区
域中存在突变时捕获靶标。随后对已捕获的靶标进行测序也可以
发现新的突变，而且在设计检测时不需要事先知道这些突变。
ngs检测可设计为以低测序深度靶向大量基因（更全面，灵敏度
较低），也可设计为以更高的测序深度靶向相对较少的基因（较不
全面，灵敏度更高）。在液体活检中，cfdna样本中的ctdna可
能较少，为了提供准确检测低丰度变异所需的灵敏度，该方法必
需使用高测序深度。因此，尽管ngs基因panel具有非常全面的
内容，但由于灵敏度的问题，它在液体活检中的应用此前一直受
到限制。
表1：?pcr和靶向ngs的比较
方法优势挑战
pcr灵敏度高只能检测有限的变异
流程熟悉几乎没有探索能力
大多数实验室已购买设备变异分辨率有限
可扩展性低，样本起始量要求高
靶向ngs更高的测序深度带来更高的灵敏度（低至1%）对少量靶标（＜20个）的测序不够经济
探索能力更强对少量靶标（＜20个）的测序不够快速
突变分辨率更高
相同的dna起始量产生更多的数据
多重检测使得样本通量更高
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结合液体活检与全景变异分析来评估体细胞变异，能检出肿瘤进
展、耐性和转移中发生的新突变。癌症是不可预测的疾病，它的
驱动基因有很多是未知的，也不能用组织类型来进行正确的估计。
液体活检与基于ngs全景变异分析的协同应用能同时评估大量基
因和多个组织，具有很高的价值（图2）。最近的研究对肿瘤样本
进行了液体活检和相应的组织活检，其结果显示，使用全面的检
测方法时，cfdna分析能检测到大量、对应的组织活检未发现的、
指南推荐的生物标记
2。
总结
癌症研究中的生物标记数量在不断地增长，这让人们对能在单一
检测中分析多个生物标记的分子方法越来越感兴趣。另一方面，
各项研究已经表明，液体活检能更全面的了解全身性肿瘤的进展，
避免局部组织活检遗漏有价值的信息。借助ngs技术的最新进展，
这两个目标都可以实现，使全景变异分析与液体活检应用所需的
灵敏度和特异性的结合成为可能。
参考文献
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3.illumina.sequencecoveragecalculator.
support.illumina.com/downloads/sequencing_coverage_calculator.html.
accessedmarch18,2019.
ngs能提供特异性、灵敏度和更多数据
最近对测序仪器的改进提供了以极高的测序覆盖深度来对单个样
本中的大部分基因组进行测序的选项。通过提供全面的内容、高
灵敏度和高特异性，ngs能以cfdna分析所需的测序深度来分析
数百个基因。这些特性让该方法不仅能评估大量的已知变异，也
能发现癌症研究中的新驱动突变。
为了提供更高的准确性，人们还使用了新的分子工具和新的生物
信息学方法。在dna文库制备中引入唯一分子标记（umi），可
以在扩增前标记每个dna分子，并用于随后的数据分析，鉴定
pcr步骤引入的错误。精密的算法可以鉴定测序杂峰，降低错误
带来的背景噪音，从而以高特异性鉴定真实变异。
变异2
病灶b
变异1变异2变异3
piom
piom
变异1
变异3
液体活检组织活检1组织活检2组织活检3
图2：?液体活检与ngs全景变异分析的完美结合?-实现液体活检与全景变
异分析结合，可以提高对肿瘤进展过程中的新突变的检出率。使用全面的
检测方法能检测基因组中造成组织异质性的新突变（变异1和变异2）。液
体活检还可以检测非原发灶的新变异（变异3）。
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